زراعة الانسجة طريقة استخدام زراعه الانسجة

استخدام زراعة الأنسجة كوسيلة سريعة للتكاثر

زراعة الأنسجة للحصول على السلالة الخضرية يتبع فى تكاثرها عدة وسائل منها زراعة الأبصال والدرنات والكورمات والمدادات والريزومات وتكوين الجذور العرضية على العقل والتطعيم و يضاف إلى ذلك التقنية الجديد المعروفة بزراعة الخلايا والأنسجة والأعضاء.

أهم الاختلافات بين وسيلة زراعة الأنسجة والوسائل التقليدية للتكاثر ما يلى :

1- صغر حجم الجزء المستعمل فى التكاثر Propagules .

2- تتم الزراعة فى وسط مائى ” على بيئة سائلة أو شبه سائلة “.

3- تتم الزراعة تحت ظروف معقمة وتحت ظروف بيئية ” حرارة وضوء ” مناسبة.

4- استخدام تلك الوسيلة للتكاثر ويمكن إنتاج أعداد كبيرة إذا ما قورنت بالطرق التقليدية.

5- خلو النباتات الناتجة بذلك التكنيك من الأمراض Pathogen free plants .

6- سهولة الاحتفاظ بتلك النباتات وتخزينها لحين الحاجة إليها.

 

 

 

 

وهناك فائدة نجنيها من استخدام هذا التكنيك فى التكاثر وهو انخفاض تكلفة الإنتاج مقارنة بالطرق التقليدية والتى تتميز بارتفاع أثمان النباتات الناتجة كما فى نباتات الزينة وبعض أنواع الفاكهة الممتازة فى صفاتها والمرغوبة تجارياً أو التى يصعب تكاثرها بالطرق التقليدية أو التى إنتاجها قليل من الفسائل مثلاً كالنخيل والذى يبلغ ثمن الفسيلة فى بعض أنواعه من 50 – 100 جنيه فضلاً على إمكانية إنتاج تلك النباتات دون ارتباط بموسم زراعى كما يحدث عند التكاثر بالوسائل التقليدية. كذلك خفض تكلفة الإنتاج للنباتات تساعد أيضاً مربى النبات على إنتاج نباتاته المحسنة, فمثلاً وجد أن نبات البطيخ ثلاثى المجموعة الكروموسومية يتكلف 1.6 إلى 2.5 دولار تنخفض تلك التكلفة للعشر باستخدام تلك التقنية فى تكاثر نبات البطيخ الثلاثى.

وللوصول لهذه الغاية هناك عدة مسالك وطرق للحصول نباتات السلالة الخضرية Alternative method of colnal multiplication

أ – Callus production Pathway

فيها تزرع Explant للحصول على الكلس خلال Stage І أما Stage ІІ حينما يكون الغرض هو الزيادة العددية للمادة المتكاثرة فيتم نقل أجزاء من الكلس على نفس البيئة ” وحوالى 0.5 جرام من الكلس ” لاستمرار نموها وزيادة Propagules ثم تنقل على بيئة جديدة يتغير فيها مكونات البيئة من حيث المستوى الهرمونى والفيتامينات .

أعلى الصفحة

وقد تتغير الاحتياجات البيئية لتكوين النموات الخضرية العرضية Adventitious shoot على الكلس خلال Stage Ш يعزل كل Shoot منفرد على بيئة تساعدة على تخلق الجذور عليه خلال مع التقسية لإمكان نقلها للتربة .

هذه الطريقة بالرغم من سهولتها وإمكان إنتاج أعداد وفيرة من النباتات منها فإنها فى بعض الحالات لا تنتج النباتات المطلوبة نظراً لتغير صفات النباتات الناتجة لحدوث تضاعف العدد الكروموسومى عند انقسام بعض الخلايا. لذلك وجد أن الأنسجة المتشابهة تشريحياً فى محتواها من الخلايا تكون كلس متجانس متشابه أما الأجزاء النباتية التى تحتوى على أنواع عديدة من الأنسجة سوف تكون كلس مختلط ومتنوع ومتضاعف ينتج عن نباتات تختلف وراثياً عن الآباء. وعليه فإن اختيار الأجزاء النباتية يجب أن يتم بكفاءة من حيث تركيبها حتى يمكن إنتاج كلس متجانس مطلوب.

ب – Axillary brunching pathway

دون المرور بمرحلة تكوين الكلس كما فى الطريقة السابقة يتم زراعة المنفصل النباتى وفى الغالب القمة النامية أو البرعم الجانبى لينمو مباشراً إلى أفرع خضرية وذلك فى Stage І أما Stage ІІ ولزيادة Propagules ينقل الـ Shoot Axillary المتكون من المرحلة الاولى إلى بيئة تساعد على تكون النموات الجانبية على ذلك النمو الخضرى Axillary branch بعداد مضاعفة ثم تعزل كل Shoot على حدى وتنقل مرة أخرى على نفس البيئة فتتكون عليها عدد آخر من Axillary shoot ، وذلك خلال Stage ІІ ثم فى Stage Ш ينقل كل Shoot على بيئة تخليق الجذور .

ج – Somatic embryogenesis pathway

يتم زراعة Explant على بيئة مناسبة تدفع المنفصل النباتى الى تكوين الأجنة العرضية مباشرا أو يتكون Callus خلال Stage І ثم تنقل على بيئة غذائية لإنماء الأجنة خلال Stage ІІ ,Ш أو تتكون الأجنة من الكلس .

وسوف نتحدث عن كل طريقة بشئ من التفصيل.

أ- Callus production pathway

يتكون الكلس عند زراعة Explant على بيئة غنية بالأكسين (1 – 10 مليجرام / لتر) ويفضل استخدام 2,4-D لدورة الواضح فى إنتاج الكلس مع مستوى منخفض من السيتوكينين بتركيز من 0 – 10 مليجرام / لتر ويفضل استخدام BA

ويمكن إضافة الأكسين منفرداً خاصة إذا استعمل فى صورة 2,4-D ولكن نظراً لدور الأكسينات فى تثبيط تكون النموات الخضرية Shoot formation لذلك ينقل الكلس بعد تكونه على بيئة محتوية على مصدر أكسينى آخر غير2,4-D مثل استخدام NAA أو IAA .

لتكوين النموات الخضرية العرضية Adventitious shoot تنقل خلال Stage ІІ على مستويات متكافئة من الأكسين والسيتوكينين 2 – 3 مليجرام / لتر لكل منهما وفى بعض الحالات تنقل على بيئة عالية من السيتوكينين ومنخفضة من الأكسين .

خلال Stage ІІ يمكن تشجيع تخليق النموات الخضرية بإضافة Adenine sulphate بتركيز 150 مليجرام / لتر ، وكذلك إضافة Casein hydralysate بتركيز 500 – 1000 مليجرام / لتر وأيضاً من المفيد إضافة Tyrosine بتركيز 1 – 10 مليجرام / لتر فهى تساعد على تخليق النموات الخضرية Shoot proliferation .

يلاحظ أثناء تخليق النموات العرضية أنة قد يصاحبها تكون كلس , هذا يعنى أن مستوى الهرمون خاصة الأوكسين منه عالى أكثر من اللازم Level are too high – ولو أن ذلك ليس بالقاعدة العامة ففى كثير من النباتات يتكون الكلس نتيجة حساسية تلك النباتات للجروح فيتكون الكلس عند السطوح المجروحة

خلال المرحلة الثالثة Stage Ш تنقل Shoot المتكون من المرحلة السابقة على بيئة جديدة لتكوين الجذور العرضية تلك البيئة تمتاز بمستواها المنخفض من الأملاح ( 1/4 ، 1/3 تركيز الأملاح فى البيئة المستخدمة خلال Stage І , Stage ІІ ) مع إضافة الأكسين فقط.

يستعمل IAA بتركيزات فى حدود 10 مليجرام / لتر وكذلك NAA , IBA بتركيزات فى حدود 0.1 – 3 مليجرام / لتر.

ترفع الإضاءة من 1000 – 10000 Lux مع إضافة الفحم النشط فى Ш Stage كذلك وجد من المفيد أيضاً إضافة بعض الفينولات مثل Caffice acid , phloroglucinal فهى تساعد على التخليق الجيد للجذور .

ب – Axillary shoots pathway

تؤخذ القمم النامية من بادرات النباتات بطول 1 – 5 مم أو قطاعات من الساق أو الجذر كمنفصل نباتى Explant وتزرع على بيئة غذائية ذات مستوى منخفض من السيتوكينين 0.05 – 0.5 مليجرام / لتر BA ومنخفض من الأكسين 0.01 – 0.1 مليجرام / لتر IBA أو تزرع Explant على بيئة ذات مستوى هرمونى متوسط من كل من الأكسين والسيتوكينين ( 2 مليجرام / لتر NAA + مليجرام / لتر Kinetin ) .

تنمو Explant إلى Shoot proliferated يفصل كل منها وتزرع على بيئة جديدة لزيادة Propagules فتتكون النموات الجانبية Axillary shoots وتكون البيئة بنفس التركيزات السابقة أو مستوى أعلى من السيتوكينين بالنسبة للأكسين 0 – 3 مليجرام IAA وفى تلك المرحلة يفضل استعمال N, isopentenyl adenine ) 2 ip ) كمصدر للسيتوكينين . ولكن ذلك ليس بقاعدة عامة فالتركيزات والهرمونات المستخدمة تختلف باختلاف النباتات كما هو مبين بالجدول (10) وقد أشار Hussey & Hepher 1978 إلى وجود استثناء على نبات Brassica mapus حيث أمكن تخليق Axillary shoot على بيئة ذات مستوى من السيتوكينين فقط بدون إضافة أكسين ويضاف السيتوكينين فى صورة BA بتركيزات تتراوح بين 0.25 – 1 مليجرام / لتر.

من الدراسات الهامة فى هذا المجال وجد أن زيادة السكر يقلل من عدد النموات الجانبية المتكونة كما وجد Davies 1980 أن أنسب تركيز للسكر كان 4 % .

وفى دراسة لنفس الباحث السابق ذكرة على سبع أصناف من الورد وجد أن الإضاءة العالية 1000 Lux خلال Stage ІІ أدت إلى إعطاء أوراق كبيرة فى الحجم وكان تخليق Axillary shoot فقيراً بالمقارنة لشدة الإضاءة المنخفضة 400 Lux عند اسنخدام نفس التركيزات من الهرمونات فى خلال Stage Ш

تنقل Shoot كلا على حدى على بيئة جديدة لتكوين الجذور وهى بيئة تحتوى على الأكسين مثل NAA بتركيزات تتراوح بين 0.25 – 0.5 مليجرام / لتر مع زيادة شدة الإضاءة من 1000 – 10000 Lux .

أعلى الصفحة

جدول (10) يبين تركيز الهرمونات المستخدمة فى كل مرحلة من مراحل التكاثر المختلفة

Stage Ш
Stage ІІ
Stage І
Plant

IAA 11.5 Mm
Kg.3Mm+IAA 0.28uM
Ls medium + k 4.4um + IAA .28 uM
البطيخ

Water melon

NAA 0.1 ppm
No changes
Ms + k 2ppm + NAA 0.04 + GA 0.1 ppm
الورد

Rose

NAA0.5 ppm or NAA0.25+IBA0.25ppm
Ba 0.25-0.4 or NAA0.1+ME500ppm
Ms + k 0.25 + NAA 2 – 5 ppm
الموالح

Citrus

NAA 0.5 ppm
Ms+IAA1.0+2ip10+Admin SO4 26.84 thiamine 0.4
MS + IAA 1.0 + BA 1.0 ppm
البجونيا

Begonia

IAA10 ppm + Tyrasine124 -30
Ms + IAA 0.5+k10+ Admin SO4 71-59+ Tyrasine124-30
MS + IAA 0.5 + k 1.0
الجربيرا Gerbera

NAA or IBA2ppm + 0-25 3% charcoal
Ms + BA 5 ppm or No change
Ms + BA3 or IAA2 + k 2.0 ppm
الموز

Banana

IBA 1 ppm
IBA+ BAI or IAA2.5 ppm + k 0.1 ppm
IBA + BA 0.1 or IAA 1.0 ppm
الفراولة Strawberries

بدون هرمون + 1000Lx
0.3IAA + k 1.0 ppm
0.1 IAA + k 0.1 ppm
القرنفل Carnation

IBA 0.5 ppm
No change
IAA 0.3 + 2ip 30 ppm
الفيكس

Ficus

NAA 0.1 ppm
No change + BA 8 ppm
0.0 NAA + BA 2 ppm
الورد

Rose

IBA or NAA, NOA 10uM + phleroglucnel
No change
BA 5-10 um
التفاح

Apple

AA0.2 or NAA0.2 + 2ip 0-0.1 ppm
2ip 0.5 ppm
2ip 0.5 ppm + NAA 0.1 ppm
الثوم

Garlic

No change
NAA 0.1 + k 2 ppm
NAA 2 + k 5.0 ppm

NAA 2 + k 1.0 ppm
الطماطم

Tomato

–
–
NAA0.01 or 1 ppm + k 5-10 ppm
البطاطس

Potato

جـ- Somatic embryogenesis pathway

تتكون الأجنة الخضرية كما يتكون الأجنة الجنسية من البيضة المخصبة أو الزيجوت ولكن ينقصها أغطية البذرة. وتتكون الأجنة الخضرية طبيعياً مثل الأجنة النيوسيلية فيما لا تقل عن 60 عائلة وتشمل 140 جنس ، 246 صنف . ومعروف الآن 21 عائلة أمكن من إنتاج الأجنة الخضرية خلال زراعة الأنسجة هذه الأجنة يمكن الحصول عليها مباشرة من زراعة Explant أو بعد تكوين الكلس كخطوة وسيطة وبتلك الوسيلة قد يمكن إنتاج ما يقرب من 1000 جنين / لكل جرام من الخلايا المزروعة وقد تصبح هذه الوسيلة هى الأساسية خاصة فى المحاصيل التى لا تتكاثر إلا عن طريق البذور تجارياً.

إن الاستعداد الوراثى عامل يجب ألا نغفله عند الرغبة فى الحصول على الأجنة الجسيمة من زراعة الأنسجة فقد وجد أن عدد الأجنة من ذلك التكنيك تزيد فى C. sinensis عن C. aurantifolia وهذا متمشياً مع درجة تعدد الأجنة فى بذورها طبيعياً حيث أنها صفة وراثية .

يلزم لهذه الأجنة أن تمد بأغطية صناعية حتى يسهل تداولها ويمكن تخزينها.

فى المرحلة الأولى تزرع Explant على بيئة ذات مستوى منخفض من الهرمونات فتتكون مبادئ خروج الأجنة العرضية ويستعمل الـ 2,4-D كمصدر للأكسين 1 – 10 مليجرام / لتر 2,4-D وتركيز منخفض من السيتوكينين 0.0 – 0.1 مليجرام / لتر BA

فى المرحلة الثانية Stage ІІ حيث يكون الغرض هو زيادة الأعضاء المتكاثرة Increasing propagules يتم نقل الأجنة الخضرية المتكونة من المرحلة السابقة لإحداث المزيد من الأجنة أما فى حالة إنتاج الكلس ولكى يزيد نسبة تكوينه ينقل أجزاء منه حوالى 50 – 100 مليجرام على نفس البيئة ثم تنقل الكلس على بيئة لتخليق الأجنة أو لتكوين أعضاء تشبه الأجنة والأبصال الكاذبة Embryoid like organs or pseudobublis , كما تتكون الاجنة من زراعة Explant من الموالح ( البرتقال الشموتى ، النازج ) على بيئة ذات مستوى من السيتوكينين إلى الأكسين قريب من 100 : 1 , وفى الغالب تتكون الأجنة على بيئة ذات مستوى عالى من الكينتين 2.5 – 0.25 مليجرام ويفضل استعمال BA بتركيزات من 0.1 -1 مليجرام / لتر أو بالإضافة إلى مستوى منخفض من الأكسين بتركيز 0.1 مليجرام فى صورة NAA أو IAA

وجد أنة من المفيد لزيادة تخليق الأجنة الخضرية إضافة Adenine بتركيز 2 مليجرام / لتر أو Adenine sulphate بتركيز 10 مليجرام / لتر مع استعمال تركيز عالى من النتروجين بإضافة نترات الأمونيوم بتركيز 170 مليجرام / لتر وكذلك زيادة تركيز البوتاسيوم . كذلك إضافة مستخلص الشعير بتركيز 500 – 1000 مليجرام / لتر .

وقد وجد Buttan & Barman 1971 أن مستخلص الشعير Malt extract له تأثير منشط على إنتاج الأجنة وكذلك زراعة البويضة غير المخصبة للبرتقال أبو سره . ولم يعرف للآن دور مستخلص الخميرة أو الشعير فى تنشيط تخليق الأجنة ولكن يعتقد أنه يحتوى على واحد أو أكثر من الأحماض الأمينية الهامة .

وجد Rangasuiami 1961 أن السكر بتركيز عالى ضرورى لتشجيع الأجنة فى حين لم يكن له نفس الأهمية عند تنمية الأجنة الكاملة Embryo culture .

أشارت الدرسات على أن الظلام يشجع من تخليق الأجنة الخضراء عند تعريض الزراعات الضوء. ووجد أن التهوية للبيئة المستعملة أمر هام لأن نقص التهوية يؤدى إلى التنفس الهوائى فيتراكم الكحول فيؤدى إلى سمية الخلايا والأنسجة.