موقع المهندس موقع المهندس بيت كل مهندس عزل المسببات المرضية الفطرية
طريقة وضع الأنسجة في أطباق البيئة:
- يتم غسل الأجزاء النباتية المتسخة بالماء الجاري (الجذور).
- يعقم البنش بقطعة صغيرة من القطن مبللة بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم (محلول الكلوركس 10%) أو بواسطة 75% من كحول ايثانول.
- يفتح الغاز وإشعال اللهب (موقد بنزن).
- تقطع البقع (العينة المرضية) مع قليل من النسج السليم حولها إلي قطع صغيرة تتراوح من 2-4 مم.
- توضع القطع الصغيرة (نصفها من النسيج المريض والنصف الأخر من النسيج السليم) في طبق بتري يحتوي على محلول كلوركس بتركيز 10% لمدة تتراوح من2-3 دقائق أو أكثر، ويتوف ذلك على نوع وعمر النسج النباتي بادرات صغيرة العمر أو نباتات كبيرة – نباتات حولية أو أشجار خشبية).
- يتم نقل القطع الصغيرة بواسطة ملقط معقم (يتم تعريض طرف الملقط فوق اللهب لدرجة الأحمرار ثم يغمس في كحول ايثانول 70% ثم يعرض للهب مرة اخرى) ثم تأخذ قطعة النسيج النباتي وتنقل إلي ورق ترشيح للتخلص من الزائد من محلول الكلوركس أو تنقل إلي طبق بتري يحتوى على ماء معقم ثم إلي ورق الترشيح.
- تنقل قطع النسيج النباتي من ورق الترشيح بعد التخلص من الزائد من محلول الكلوركس بواسطة ملقط معقم إلي أطباق بتري تحتوي على بيئة PDA حيث يوضع 4 قطع لكل طبق بتري وتكون كل قطعة بالقرب من حافة الطبق.
- تنقل الأطباق في الحضان على درجة حرارة 26-28 مْ وتوضع مقلوبة ويفضل وضعها داخل كيس بلاستيك أو لف الطبق بواسطة البارافيلم لمنع تلوثها بواسطة الحلم.
- الغرف الرطبة:
بعض الفطريات التي تصيب المجموع الخضري أو الأجزاء النباتية الموجودة فوق سطح التربة يمكن عزلها باستعمال الغرف الرطبة حيث تشجع الفطريات على التجرثم وهي طريقة سريعة لتعرف على المسبب المرضي في خلال من1-2 يوم.
- يوضع في طبق بتري معقم ورق ترشيح مقاس 9 سم ثم تضاف قليل من الماء المعقم تكفي لتبلل ورقة الترشيح.
- توضع الأجزاء النباتية في الطبق الذي يحتوي على ورق ترشيح مبلل وتحضن الأطباق على البنش أو الضوء لمدة 1-3 أيام.
- يتم فحص الجراثيم لتعرف على المسبب المرضي أو تلقط الجراثيم بواسطة إبرة معقمة وتضع في طبق يحتوي على بيئة آجار البطاطس والدكستروز وتحضن في الحضان لمدة من 5- 7 أيام ثم تفحص الجراثيم بواسطة المجهر الضوئي.
تعريف المسببات المرضية عن طريق استخدام التقنيات الحديثة:
توجد أجهزة وتقنيات حديثة مثل طريقةPCR وجهاز Biolog لتعريف مسببات الأمراض الفطرية وتسهل الكثير من الأجهزة الحديثة من سرعة تشخيص المرض النباتي حيث أصبحت هذه الأجهزة الحديثة واسعة الانتشار.
The Biolog Systems
تتطورت طريقة هذا النظام منذ عام 1980 وهذا النظام The Biolog Systems يمكن عن طريقه تعريف أكثر من 1900 نوع من البكتيريا والخمائر والفطريات ويوجد منه ثلاثة أنواع:
- Fully Automated systems
- Semi Automated systems
- Manually Read Systems
وتعتمد فكرة هذا النظام في تعريف الكائنات الحية الدقيقة (فطريات –
بكتيريا – خمائر) هي عندما يتوفر للكائن الحي مدى واسع من مصادر الكربون في طبق الخاص بالجهازMicro plate فأنه ينتج بعض الصفات المميزة نتيجة عمليات الأيض وتعرف ببصمة الأصبع الأيضية Fingerprint) Metabolic.). وفي السنوات القليلة الماضية حدث تطور سريع في بصمة الأصبع الأيضية حيث انه يمكن الحصول على نتائج التعريف خلال 4 ساعات أو أقل وتقرأ وتسجل في ثواني، حيث انها تقارن بقواعد المعلومات وذلك لتعريف النهائي.
ويستخدم هذا النظام في مجالات تطبيقية (الزراعة – أمراض النبات- المكافحة الحيوية – الأبحاث – معامل التحليل وغيرها).
مكونات النظام:
تشمل على حضان incubator، تحليل البياناتAnalyzer ، جهاز كمبيوتر Computer ، طباعةprinter ، سوفت وير Softwear لقراءة أطباق الجهاز Biolog-micro plate ، مقياس على شكل مخروط لتجهيز وأعداد اللقاح inocula ، لمبة مضيئة لتكبير المزرعة، ماصة الكترونية بها 8 قنوات، قاعدة معلومات Databases.
ويتطلب التعريف وجود مزرعة نقية من الكائن المراد تعريفه (فطر – بكتيريا – خمائر) في بيئة النمو الخاصة بالجهاز (Biolog Universal Growth media)، ويمكن التأكد من المزرعة النقية عن طريق استخدام اللمبة المضيئة المكبرة لملاحظة أي تغيرات في الشكل المورفولوجي للمزرعة في اللون او الحجم أو حافة المزرعة.
FF Microplate: أطباق صغيرة لتعريف الفطريات
تحتوي على 96 حفرة (بئر) Well منها 95 حفرة تحتوي مصادر كربون مختلفة مع حفرة للشاهد تحتوي على ماء، وترتبط مصادر الكربون مع ملح التترازلويم Tetrazolium salt. تخفف العينة النقية وتوضع في الحفرة ثم تحضن في الحضان ويتم تحليلها بعد التحضين. إذا استخدمت البكتيريا مصدر الكربون أثناء عمليات الأيض حيث يحدث أكسدة للمادة التفاعل ويختزل التترازوليم وبذلك يظهر اللون الأحمر نتيجة اختزال ملح التترازوليم
(2,3,5, triphenyle tetrazolium chloride —–► triphenyl formazan)
ويتم قراءة الطبق بنظام قاعدة المعلومات السابق تخزينها.
وعن طريق هذا النطام يمكن تعريف حوالي 250 الف نوع من الفطريات عن طريق استخدام اطباق FF Microplate مع Microlog software. وفي المستقبل سيحلق بقاعدة المعلومات اشكال الفطريات على بيئة Malt Extract Agar وبيئة Czapek Yeast Autoysate Agar مع صور فتوغرافية مجهرية للفطر.
طريقة استخدام FF Microplate : (شكل رقم 1)
- يتم تنمية المزرعة الفطرية على بيئة 2% (Malt extract Agar).
- يتم مسح وتجميع الجراثيم الكونيدية للفطر من على سطح البئية الصلبة، ويأخذ معلق الجراثيم بكثافة معينة Specified Density)) ويتم تلقيح الأطباق FF Microplate
- يضاف معلق الجراثيم بمعدل 100 ul في كل حفرة الموجودة في طبق FF Microplate
- تحضن أطباق FF Microplate في الحضان على درجة حرارة 26م ْ لمدة 24-96 ساعة.
- يتم قراءة الأطباق FF Microplate مستخدماً MicroStation Readear.
وتحتوي قاعدة المعلومات على أنواع مختلفة من الفطريات:
- الفطريات الممرضة للنبات:
مثل: Fusarium, Colletotricium, Phoma, Botrytis وغيرها
- الفطريات الممرضة للإنسان:
مثل Stachybotrys, Scopulariopsis, Paecilomyces, Cladosporium, Alternaria, Fusarium, Aspergillus وغيرها.
- فطريات Indoor air:
مثل Pencillium, Aspergillus, Eurotium, Rhizopus, Stachybotrys,Neurospora, Wallemia وغيرها.
